CPEB1

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 416 (2023) Citar este artículo

2732 Accesos

1 Citas

6 altmétrico

Detalles de métricas

Se publicó una corrección del autor de este artículo el 6 de febrero de 2023.

Este artículo ha sido actualizado

Las causas moleculares del deterioro de la calidad de los ovocitos durante el envejecimiento están mal definidas. Dado que la competencia del desarrollo de los ovocitos depende de regulaciones postranscripcionales, probamos si la traducción defectuosa del ARNm contribuye a esta disminución de la calidad. La alteración de la carga de ribosomas en las transcripciones maternas está presente en los ovocitos viejos. Utilizando un enfoque candidato, detectamos una traducción alterada de los informadores 3'-UTR y una longitud poli(A) alterada de los ARNm endógenos. La poliadenilación del ARNm depende de la proteína 1 de unión a la poliadenilación citoplásmica (CPEB1). La traducción del ARNm de Cpeb1 y los niveles de proteína disminuyen en los ovocitos viejos. Esta disminución provoca la desrepresión de la traducción de Ccnb1 en ovocitos inactivos, la activación prematura de CDK1 y la reentrada acelerada en la meiosis. La desrepresión de Ccnb1 se corrige mediante la inyección de ARNm de Cpeb1 en ovocitos viejos. La haploinsuficiencia de Cpeb1 específica de ovocitos en ovocitos jóvenes recapitula todos los fenotipos de traducción de ovocitos viejos. Estos hallazgos demuestran que una disfunción en el programa de traducción de los ovocitos se asocia con la disminución de la calidad de los ovocitos durante el envejecimiento.

La pérdida de la homeostasis y la disminución de la capacidad para responder a los desafíos metabólicos es una característica del envejecimiento celular1. Sin embargo, la disminución de las funciones celulares relacionada con el envejecimiento no progresa de forma sincrónica en todas las células y tejidos del cuerpo. Un ejemplo sorprendente es el ovario, donde una disminución relacionada con la edad en el número y la calidad de los ovocitos provoca una disminución de la fertilidad que precede a otras pérdidas de función inducidas por el envejecimiento2. Aunque las pacientes de edad avanzada pueden llevar un embarazo a término con la donación de ovocitos3,4, la disminución en la competencia de desarrollo de los ovocitos es un obstáculo importante en el entorno de las tecnologías de reproducción asistida (TRA). La disminución de la calidad de los ovocitos se ha atribuido a varias causas, siendo las más informadas una mayor incidencia de aneuploidía del óvulo o del embrión y la inestabilidad genómica causada quizás por errores epigenéticos o alteraciones metabólicas5,6,7.

La capacidad del ovocito para desarrollarse como embrión y soportar el embarazo a través de un nacido vivo depende de un conjunto complejo de procesos de desarrollo, incluida la adquisición coordinada de la competencia meiótica y citoplasmática del gameto8,9. Menos claro está el papel de la competencia citoplasmática en la disminución de la fertilidad con la edad. La maduración citoplasmática incluye el ensamblaje de la maquinaria molecular necesaria para completar la meiosis, para la reprogramación de la morfología de los orgánulos y su redistribución dentro del ovocito. Cabe destacar que tras la fecundación el citoplasma del ovocito se transfiere al cigoto. Por tanto, la activación transcripcional del genoma embrionario tiene lugar en este ambiente materno9,10,11. Varias observaciones en la práctica de TRA apuntan a una competencia citoplasmática defectuosa como causa de la disminución de la aptitud del embrión para desarrollarse e implantarse12.

La maduración de los ovocitos es el último paso de la ovogénesis. En un lapso de varias horas, un ovocito detenido en la Profase I (también llamado ovocito en etapa de vesícula germinal (GV)) vuelve a entrar en la meiosis en respuesta al aumento de la hormona luteinizante (LH), sufre una ruptura de la envoltura nuclear (NEBD o ruptura de la vesícula germinal, GVBD). ), completa la primera división meiótica y finalmente se detiene en la etapa MII de la meiosis. Luego, los ovocitos MII se ovulan y están listos para ser fertilizados. La extracción de un ovocito completamente desarrollado detenido por GV del folículo antral inicia una cascada de eventos llamados maduración espontánea que recapitula la maduración hasta la etapa MII in vitro. Durante estas etapas finales de la maduración de los ovocitos, la síntesis de proteínas críticas para la competencia del desarrollo se basa en un programa de traducción cronometrada de ARNm de larga vida que se han sintetizado anteriormente durante el crecimiento de los ovocitos13,14,15. Por tanto, la expresión génica en los ovocitos está controlada por la traducción en el citoplasma y no por la transcripción en el núcleo. Esta propiedad, compartida por los gametos de la mayoría de las especies16, indica claramente que el programa de traducción ejecutado en la transición de ovocito a cigoto es integral para la adquisición de la competencia del desarrollo. Hemos proporcionado evidencia de que los defectos en el programa de traducción están asociados con una competencia de desarrollo comprometida en el ratón17,18,19. Un mecanismo central de regulación de la traducción de los ARNm maternos se basa en la modulación dinámica de la cola poli(A) asociada con la región no traducida 3' del ARNm (3'-UTR)20. Un regulador importante de la poliadenilación es la proteína 1 de unión al elemento de poliadenilación citoplasmática (CPEB1)20,21. Esta proteína de unión a ARN modula la traducción de los ARNm que contienen el elemento de poliadenilación citoplasmático (CPE). Nuestro análisis de todo el genoma reveló un cambio global en la traducción del ARNm materno que coincide con la reentrada de los ovocitos en el ciclo celular meiótico y el papel crucial de CPEB1 en la dirección de este cambio15.

Aquí, proponemos la hipótesis de que una ejecución defectuosa del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración de los ovocitos también conduce a una competencia de desarrollo comprometida observada durante el envejecimiento materno. A diferencia de los numerosos estudios transcriptómicos publicados sobre el envejecimiento de los ovocitos22,23,24,25, hay poca información disponible sobre si los defectos en el programa de traducción contribuyen a la disminución de la calidad de los ovocitos relacionada con la edad26,27. Utilizando una estrategia de inmunoprecipitación (IP) RiboTag28 en ovocitos de ratón29, hemos comparado la carga de ribosomas en ovocitos MII de ratones jóvenes y viejos. Proporcionamos evidencia de defectos en el programa de traducción de ARNm en ovocitos derivados de ratones hembra viejos, una alteración que se asocia con una función disminuida de CPEB1. A su vez, estos defectos probablemente contribuyan a la disminución de la competencia del desarrollo y a la infertilidad asociada a la edad.

Estudios anteriores han examinado el transcriptoma en ovocitos inactivos (GV) y maduros (MII) de ratones jóvenes y viejos (conjunto de datos GDS3295)24. Una conclusión de este estudio es que un número significativo de transcripciones disminuye en los ovocitos envejecidos24. Sin embargo, nuestro nuevo análisis de estos conjuntos de datos también muestra que los niveles de transcripciones 2109 aumentan significativamente de GV a MII en ovocitos jóvenes (Figura complementaria 1a). La maduración de los ovocitos de ratón se produce en ausencia virtual de transcripción, ya que los ovocitos completamente maduros muestran una cromatina altamente condensada y la síntesis de ARN está en el nivel de fondo13. Dado este silenciamiento transcripcional en todo el genoma, los niveles de ARNm en los ovocitos en maduración solo deberían permanecer estables o disminuir, siendo la disminución causada por la desestabilización/degradación15,30. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el aumento generalizado de los niveles de transcripción se debe a un sesgo hacia especies de ARNm poliadenilado introducidas durante la síntesis de ADNc utilizando cebadores oligo(-dT), una posibilidad también planteada en la publicación original24. El aparente aumento en los niveles de ARNm reflejaría entonces diferencias en la poliadenilación/traducción en lugar de niveles de ARNm en estado estacionario, una posibilidad también propuesta en otros estudios transcriptómicos de ovocitos31,32. De hecho, una comparación de transcripciones aparentemente aumentadas en GDS329524 con nuestros conjuntos de datos que investigan la carga de ribosomas muestra una superposición considerable con los ARNm activados (Figuras complementarias 1a-c). Además, la medición directa de la longitud del poli (A) y la eficiencia del cebado del oligo (-dT) confirma dicha correlación (Figura complementaria 2). Por lo tanto, las diferencias aparentes entre los ovocitos jóvenes y viejos que se encuentran en el transcriptoma envejecido pueden indicar una poliadenilación defectuosa (Figura complementaria 1d) en lugar de niveles de transcripción alterados.

Para evaluar directamente esta posibilidad, comparamos el transcriptoma y el translatomo en ovocitos MII de ratones jóvenes (1 mes) y viejos (12 a 15 meses) utilizando la estrategia de carga de ribosomas RiboTag IP/RNA-Seq y la preparación de la biblioteca de cebado aleatorio. Las propiedades de las muestras de ovocitos se informan en las figuras complementarias 3a-e, y el análisis de control de calidad de los datos de RNA-Seq se informa en las figuras complementarias 4a, b. Con la excepción de 47 ARNm, los niveles totales de ARNm (entrada) no difirieron significativamente entre los ovocitos MII jóvenes y viejos (FDR <0,05, Fig. 1a). Por el contrario, la carga de ribosomas disminuyó significativamente para 254 ARNm y aumentó para 38 ARNm en ovocitos viejos en comparación con ovocitos jóvenes (FDR <0,05. Fig. 1b). La lista de genes de entrada y HA significativamente diferentes se proporciona en los Datos complementarios 1 y 2. Relajar el rigor estadístico a FDR <0,1 aumentó el número de ARNm con carga de ribosomas significativamente alterada a 726. El análisis de ontología genética de los ARNm disminuidos y aumentados mostró enriquecimiento en términos que incluyen “mitocondria” y “núcleo” (Fig. 1c). Una mayor extracción de datos mostró que la eficiencia de la traducción de un número significativo de ARNm que codifican proteínas ribosómicas mitocondriales se altera en los ovocitos viejos en comparación con los jóvenes, aunque los niveles de entrada son comparables (Fig. 1d). Se ha informado de alteraciones en la traducción del ARNm de la proteína ribosómica mitocondrial en varios tejidos de un organismo que envejece33,34,35, y la disfunción de las mitocondrias durante el envejecimiento está bien establecida36, incluso en el caso de los ovocitos37. Por lo tanto, nuestro análisis RiboTag IP/RNA-Seq detectó cambios que se asocian con el envejecimiento y proporcionó una indicación de que la alteración de la traducción del ARNm está presente en los ovocitos viejos.

Se recolectaron ovocitos MII de ratones RiboTagF/F jóvenes y viejos; Zp3-Cre y RiboTag IP seguido de RNA-Seq se realizó como se describe en "Métodos". Se utilizan dos muestras biológicas independientes. a, b Se informa el diagrama MA de los cambios en la expresión génica para las transcripciones totales (a) y la carga de ribosomas en las transcripciones (b). Los cambios de log2 para ovocitos jóvenes frente a viejos se representan en el eje y y el log10 de los recuentos promedio por millón de lecturas (CPM) se muestra en el eje x. Cada gen está representado por un punto. Los genes con FDR <0,05 se muestran en rojo (regulados al alza) o azul (regulados a la baja). c Análisis de ontología genética de ARNm cuya traducción es significativamente (FDR <0,1) diferente entre ovocitos jóvenes y viejos, incluidas transcripciones tanto reguladas hacia arriba como hacia abajo. Obsérvese el enriquecimiento altamente significativo en términos de mitocondrias. d Comparación de niveles de ARNm que codifican la proteína ribosomal mitocondrial y su eficiencia de traducción (TE) en ovocitos jóvenes y viejos. El log2 del CPM promedio se representa en el eje y. La barra representa la media \(\pm\) SEM. Un subconjunto de ARNm que codifica proteínas ribosómicas mitocondriales se traduce mal en los ovocitos envejecidos. *FDR < 0,05. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para una mejor caracterización de los defectos de traducción asociados con el envejecimiento materno, utilizamos un enfoque de gen candidato. Para capturar los cambios amplios sugeridos en el transcriptoma de envejecimiento anterior y detectados por RNA-Seq, incluimos los siguientes genes entre los candidatos analizados. Se utilizó TPX2 como control, no siendo significativamente diferente en el transcriptoma de envejecimiento y en nuestro RNA-Seq. NLRP5 (MATER), un componente del complejo materno subcortical38 para el cual se detectó un aumento en RNA-Seq y en el transcriptoma del envejecimiento, se utilizó como un prototipo de ARNm regulado positivamente durante el envejecimiento. Se utilizaron Golph3, Il7 y Thumpd1 como ARNm regulados negativamente representativos, y se detectó una disminución en uno o ambos conjuntos de datos. GOLPH3 es un componente del aparato de Golgi, un orgánulo que sufre una importante reestructuración durante la maduración de los ovocitos39. THUMPD1 codifica una proteína de unión a ARN implicada en la acetilación del ARN y la biogénesis de ribosomas40. Anteriormente hemos demostrado que la traducción del ARNm de IL7 y la secreción de proteínas aumentan durante la maduración de los ovocitos, y su acumulación en el líquido folicular (FF) de pacientes con fertilización in vitro (FIV) se correlaciona con la maduración de los ovocitos y la calidad del óvulo41. Dada esta correlación entre la secreción de IL7 y la calidad de los ovocitos, incluimos este candidato porque disminuye significativamente en el transcriptoma envejecido, aunque no se detectaron cambios en la traducción para este ARNm en el conjunto de datos de RNA-Seq.

Los reporteros se generaron fusionando la proteína fluorescente YFP mejorada con la 3'-UTR de los ARNm de Tpx2, Nlrp5, Golph3, Il7 o Thumpd1. Después de la traducción in vitro, estos ARNm de construcción se inyectaron junto con un ARNm de mCherry en ovocitos desnudos de ratones jóvenes y viejos, y la velocidad de traducción se controló mediante microscopía de lapso de tiempo durante la maduración (Fig. 2a). Utilizada como control de carga, la señal de mCherry fue comparable para todos los reporteros entre ovocitos jóvenes y viejos (Figura complementaria 5). El patrón de traducción se puede dividir en tres categorías principales. Además de un patrón de traducción constitutiva, los ARNm experimentan una traducción disminuida durante la maduración de los ovocitos como Nlrp5, mientras que se observa una traducción activada para otro grupo, incluidos Il7, Thumpd1 y Golph3. La figura complementaria 6 destaca dos patrones opuestos de carga de ribosomas durante la maduración y la acumulación de YFP en ovocitos mantenidos en GV o durante la maduración in vitro. La traducción de Nlrp5 en ovocitos jóvenes disminuyó progresivamente hasta una meseta (Figuras complementarias 6c y 2d), lo que refleja la represión de la traducción, un hallazgo compatible con la carga de ribosomas (Figuras complementarias 1c y 6a). Sin embargo, en los ovocitos viejos, la tasa de traducción de este informador fue inicialmente comparable en los dos grupos pero, con el tiempo, no se estabilizó como en los ovocitos jóvenes (Fig. 2d). Esto sugiere que la traducción en ovocitos viejos no se reprime correctamente, un hallazgo consistente con los datos del transcriptoma de envejecimiento y la carga de ribosomas. La acumulación de YFP impulsada por Golph3, Il7 y Thumpd1 3'-UTR se activó aproximadamente 3 h después de GVBD y continuó aumentando a partir de entonces (Figuras complementarias 6d y 2f, h, j), hallazgos nuevamente consistentes con la carga de ribosomas. (véanse las figuras complementarias 1c y 6b). Sin embargo, se detectó una disminución de la acumulación del indicador en ovocitos viejos para las tres 3'-UTR. Para cuantificar las diferencias en la traducción del informador, se calculó la tasa de acumulación para cada ovocito inyectado mediante ajuste de curvas42. Con este enfoque, la tasa de traducción de Golph3, Il7 y Thumpd1 disminuye significativamente en los ovocitos viejos en comparación con los jóvenes (Fig. 2g, i, k), mientras que la traducción de Nlrp5 aumenta significativamente en los ovocitos viejos (Fig. 2e). No se detectó ninguna diferencia en la traducción en Tpx2 (Fig. 2b, c), lo que confirma que la traducción alterada no es un fenómeno generalizado. Por lo tanto, la acumulación aumentada, disminuida o sin cambios de estos informadores es consistente con los cambios aparentes en el transcriptoma de envejecimiento y con nuestros datos de carga de ribosomas.

un esquema de ensayo del reportero de YFP. A los ovocitos GV de ratones jóvenes y viejos se les inyectaron 12,5 ng/μl de mCherry poliadenilado y 12,5 ng/μl de informadores de YFP oligoadenilados, incluidos Tpx2, Nlrp5, Il7, Thumpd1 y Golph3 3'-UTR. Después de la preincubación durante la noche, los ovocitos se liberaron en medio libre de cilostamida y las señales de YFP y mCherry se registraron mediante microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos durante 20 h durante la maduración. Las señales de YFP se normalizaron por el nivel de las señales de mCherry. b, d, f, h, j La relación de la señal YFP/mCherry para cada ovocito se representó de acuerdo con el tiempo de incubación (d) o con el tiempo de GVBD establecido en 0 (b, f, h, j). c, e, g, i, k Las tasas de traducción se calcularon para cada ovocito mediante regresión lineal de los datos del indicador entre 5 y 10 h (b, j), entre 7 y 12 h después de GVBD (f, h), o entre 15 y 20 h después del tiempo de incubación (d). Los experimentos se repitieron tres veces con diferentes lotes de ovocitos de diferentes cohortes de ratones envejecidos y los datos se muestran como la media \(\pm\) SEM. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas de dos colas para evaluar la significación estadística, ns no significativo, e ***P = 0,0008, g ****P < 0,0001, h ****P < 0,0001, k ***P = 0,0002. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado nuestro hallazgo anterior de que la traducción en los ovocitos es sensible a la presencia de células del cúmulo circundante17, luego probamos si la traducción en estas condiciones más fisiológicas se alteraba en los ovocitos viejos. Cuando los ovocitos todavía están rodeados por las células del cúmulo, son difíciles de monitorear mediante microscopía de lapso de tiempo debido al movimiento a medida que el cúmulo se expande. Por lo tanto, utilizamos reporteros de luciferasa de Renilla (RL) fusionados con la 3'-UTR del ARNm objetivo inyectados junto con luciferasa de luciérnaga (FL) en los ovocitos mientras aún estaban rodeados de células del cúmulo (COC) (Figura complementaria 7a). Al final de la incubación, los ovocitos fueron desnudos, lisados ​​y utilizados para el ensayo de luciferasa. En todos los casos, la traducción de reporteros aumentó de GV a MII (Figuras complementarias 7b-d). De acuerdo con los datos de los ovocitos desnudos, la traducción de Il7 y Thumpd1 nuevamente disminuyó significativamente en los ovocitos MII viejos en comparación con los ovocitos MII jóvenes (Figura complementaria 7c, d), mientras que no se detectó ninguna diferencia en la traducción de Tpx2 (Figura complementaria 7b). Por lo tanto, mantener la interacción entre células somáticas y germinales no rescata la traducción defectuosa.

En los ovocitos, la activación de la traducción depende del alargamiento de la cola poli(A) de un ARNm. Para evaluar esta propiedad, comparamos el estado de poliadenilación de los ARNm endógenos de Tpx2, Il7 y Thumpd1 en ovocitos jóvenes y viejos utilizando una estrategia en la que se comparan las señales de qPCR del ADNc sintetizado mediante oligo (-dT) o cebado aleatorio. Este es un ensayo ampliamente utilizado cuando hay un número limitado de células disponibles43. Como se informa en las figuras 3a a c, las tres transcripciones muestran un aumento aparente en MII versus GV con cebado oligo (-dT), mientras que no se observaron cambios significativos con cebado aleatorio. Esto es consistente con la hipótesis de que la poliadenilación de los tres transcritos aumenta durante la maduración de los ovocitos. Más importante aún, al comparar ovocitos jóvenes y viejos, las señales del cebado oligo (-dT) disminuyeron significativamente para los ARNm de Il7 y Thumpd1 (Fig. 3b, c), mientras que la poliadenilación de Tpx2 nuevamente se mantuvo sin cambios (Fig. 3a). Estos datos indican que la poliadenilación endógena es defectuosa en los ovocitos viejos, un hallazgo consistente con la disminución de la traducción detectada con los ensayos del indicador. Para extender la correlación oligo(-dT)/cebado aleatorio a ARNm adicionales, comparamos los datos MII depositados obtenidos con el cebado oligo(-dT) y nuestro conjunto de datos de cebado aleatorio. La proporción de oligo(-dT)/cebado aleatorio es comparable en muestras MII jóvenes y viejas para la mayoría de los genes. Sin embargo, se detectaron diferencias significativas en la proporción para un subgrupo de transcripciones. Estos incluyen las transcripciones que codifican Il7, Thumpd1, Golph3 y Nlrp5. Además, se detectaron cambios para Cpeb1 y Ccnb1 (ver más abajo), mientras que no se observaron diferencias en la proporción para Tpx2 y Ccnb2 (Fig. 3d). Por tanto, estas proporciones alteradas son consistentes con una poliadenilación defectuosa del ARNm durante el envejecimiento.

El ARN a-c de ovocitos GV o MII de ratones jóvenes o viejos se transcribió de forma inversa utilizando cebadores hexámeros aleatorios u oligo(-dT), y se realizó una PCR cuantitativa con cebadores específicos de genes. Los datos se normalizan mediante la expresión promedio de Dppa3, Rpl19, ActB y Eif4a1 como se detalla en "Métodos". an = 3 (GV joven aleatorio), 3 (MII joven aleatorio), 4 (GV joven oligo(-dT)), 4 (MII joven oligo(-dT)), 2 (GV antiguo aleatorio), 2 (MII antiguo aleatorio) ), 3 (oligo(-dT) antiguo GV), 3 (oligo(-dT) antiguo MII) se utilizan muestras biológicamente independientes. bn = 3 (GV joven aleatorio), 7 (MII joven aleatorio), 4 (GV joven oligo(-dT)), 4 (MII joven oligo(-dT)), 2 (GV antiguo aleatorio), 2 (MII antiguo aleatorio) ), 3 (oligo(-dT) antiguo GV), 4 (oligo(-dT) antiguo MII) se utilizan muestras biológicamente independientes. cn = 4 (GV joven aleatorio), 5 (MII joven aleatorio), 5 (GV joven oligo(-dT)), y 7 (MII joven oligo(-dT)), 3 (GV viejo aleatorio), 3 (MII viejo aleatorio), 5 (oligo(-dT) antiguo GV), 5 (oligo(-dT) antiguo MII) se utilizan muestras biológicamente independientes. Los datos se muestran como la media \(\pm\) SD. Se utilizaron pruebas t de Student pareadas de dos colas para evaluar la significación estadística, ns no significativa, *P = 0,029, ***P = 0,0003. d Se informa la proporción de datos de oligo (-dT) 24 y bibliotecas de RNA-Seq cebadas aleatoriamente entre ovocitos jóvenes y viejos. Se utilizan cuatro muestras de oligo(-dT) biológicamente independientes y dos muestras cebadas aleatorias biológicamente independientes. Los datos se muestran como la media \(\pm\) SD. Se detecta una proporción significativamente menor para los ARNm de Il7, Thumpd1, Ccnb1, Golph3 y Cpeb1. Por el contrario, los supuestos cambios en la poliadenilación de los ARNm de Ccnb2 y Tpx2 no se ven afectados. Se utilizaron pruebas t múltiples no pareadas de dos colas para evaluar la significación estadística, ns no significativo, **P = 0,0032 para Il7, ***P = 0,000061 para Thumpd1, **P = 0,0025 para Golph3, *P = 0,019 para Cpeb1, *P = 0020 para Ccnb1, ***P = 0,00087 para Nlrp5. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La poliadenilación de los ARNm y su traducción durante la maduración de los ovocitos depende, en gran parte, de la función de la proteína de unión a ARN (RBP) CPEB120. Este RBP interactúa con elementos que actúan en cis ubicados en la 3'-UTR de un ARNm y ensambla un complejo que promueve la adenilación. Se identificaron CPE putativos en los ARNm de Il7, Thumpd1 y Golph3, pero no en los ARNm de Nlrp5. Además, el ARN-IP con anticuerpos CPEB1 confirma de manera concluyente la unión específica de CPEB1 a los ARNm endógenos de Il7, Thumpd1 y Golph3 en el ovocito (Figura complementaria 8). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que una función defectuosa de CPEB1 puede ser una causa de una disminución de la poliadenilación y traducción de estos ARNm en ovocitos envejecidos. De hecho, los datos de RiboTag IP/RNA-Seq indican que, aunque no alcanza significación estadística, la eficiencia de traducción (TE)44, definida como la relación entre los niveles de ARNm total y unido a ribosomas, para el ARNm de Cpeb1 disminuye ~50% en ovocitos durante el envejecimiento materno, mientras que los niveles totales de ARNm son comparables entre ovocitos jóvenes y viejos (Fig. 4a). Para confirmar esta observación, realizamos RiboTag IP/qPCR utilizando extractos de ovario de ratones jóvenes y viejos. Dado que la recombinasa Cre en el ratón RiboTag es impulsada por el promotor ZP3, la IP de RiboTag del extracto de ovario total sondea solo la traducción en ovocitos desde los folículos secundarios a los antrales. Usando este enfoque, el ARNm total de Cpeb1 (entrada) no difirió entre ovarios jóvenes y viejos (Fig. 4b); sin embargo, el ARNm unido a ribosomas disminuyó significativamente en los ovarios de ratones viejos (Fig. 4c) (P <0,01). La disminución de la traducción del ARNm de Cpeb1 se confirmó además mediante una transferencia Western de ovocitos de ratones jóvenes y viejos. Los niveles de proteína CPEB1 disminuyen significativamente en ~ 50% en ovocitos viejos en comparación con los jóvenes (Fig. 4d, e). Es de destacar que se encuentra una disminución "aparente" y significativa en los niveles de CPEB1 en ovocitos viejos con el transcriptoma envejecido (Fig. 1d complementaria), así como una disminución aparente en la poliadenilación (Fig. 3d). Estos resultados sugieren que la disminución en la expresión de la proteína CPEB1 en ovocitos viejos se debe a una disminución de la traducción durante las etapas de crecimiento del folículo, así como durante la maduración.

Se recolectaron ovocitos MII de RiboTagF/F jóvenes y viejos; ratones Zp3-Cre y RiboTag IP seguido de RNA-Seq se realizó como se describe en "Métodos". Se informa el CPM promedio para las transcripciones totales (entrada) y la carga de ribosomas de las transcripciones (HA). TE se calculó como la relación entre el CPM de ARNm total y asociado a ribosomas. En este análisis se utilizaron dos muestras biológicas independientes. b, c Se recogieron ovarios de ratones RiboTagF/F jóvenes y viejos; Zp3-Cre y RiboTag IP seguido de RT-qPCR se realizó como se describe en "Métodos". Se utilizó Dppa3 como gen de referencia. Se informan los datos de entrada (b) y el ARNm de carga de ribosomas (c). bn = 4 (jóvenes), 6 (viejos) se utilizan muestras biológicamente independientes. cn = 5 (jóvenes), 7 (viejos) se utilizan muestras biológicamente independientes. Las reacciones de RT-qPCR se realizaron por triplicado. Las barras representan la media ± DE. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, ns no significativa, **P = 0,0048. d, e Expresión de la proteína CPEB1 en ovocitos GV de ratones jóvenes y viejos. Se utilizó como control la acumulación de α-tubulina. Los ovocitos se lisaron en tampón de muestra y se utilizaron para análisis de transferencia Western. Para el experimento se cargaron veinticinco ovocitos por carril. Se informa un representante de tres experimentos. Un gráfico muestra la cuantificación de una transferencia Western en tres réplicas biológicas independientes. Los datos se expresan como la media \(\pm\) DE. Las proporciones CPEB1/α-tubulina se expresaron como cambios en comparación con los controles jóvenes. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas de dos colas para evaluar la significación estadística, **P = 0,0012. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

CPEB1 es un RBP crítico con funciones complejas durante el desarrollo de los ovocitos. También se considera un importante regulador de la progresión a través del ciclo celular meiótico, dado su papel en la regulación de la traducción de reguladores críticos del ciclo celular, incluidas las ciclinas. Si el envejecimiento estuviera asociado con una disfunción en CPEB1, entonces se esperaría un patrón de traducción alterado del objetivo prototípico de CPEB1, Ccnb1. Esta posibilidad se verificó mediante la inyección de un indicador impulsado por la 3'-UTR de Ccnb1 en ovocitos de ratones jóvenes y viejos y probando su tasa de traducción durante la etapa GV. En los ovocitos GV completamente desarrollados, CPEB1 funciona como un represor de la traducción. De hecho, encontramos que la tasa de traducción del indicador Ccnb1 aumenta en los ovocitos GV de ratones viejos en comparación con los de ratones jóvenes (Fig. 5a, b). Como control negativo, utilizamos la traducción de otra ciclina, Ccnb2, que hemos demostrado que no está reprimida por CPEB1 en ovocitos GV15,45. No se observaron diferencias en la señal informadora de Ccnb2 entre los ovocitos GV jóvenes y viejos (Fig. 5c, d). Dado que CCNB1 funciona como una subunidad reguladora de CDK1, el regulador maestro de la progresión de la meiosis, probamos si una disfunción en CPEB1 asociada con el envejecimiento tendría algún efecto en el momento de la progresión del ciclo celular meiótico. Incubamos ovocitos en un medio de maduración y registramos el tiempo de GVBD utilizando microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos. En estas condiciones, la reentrada en la meiosis se acelera significativamente en aproximadamente 15 minutos en los ovocitos viejos (Fig. 6a). Para verificar una activación prematura de CDK1, se incubaron extractos de ovocitos con un péptido de proteína fosfatasa 1 sustrato de CDK1 (GST-PP1) y se midió la fosforilación mediante anticuerpos fosfoespecíficos (pT320-PP1)46,47,48. Teniendo en cuenta que la diferencia máxima en el tiempo de GVBD entre ovocitos jóvenes y viejos es 60 minutos después de la incubación (Fig. 6a) y que la activación de CDK1 ocurre antes de GVBD, examinamos la actividad de CDK1 en ovocitos jóvenes y viejos después de 45 minutos de eliminación del inhibidor de PDE. La actividad de CDK1 aumentó significativamente en los ovocitos viejos en comparación con los jóvenes (Fig. 6c, d). Estos resultados indican que una pérdida en la represión traslacional por parte de CPEB1 durante la Profase I provoca una mayor acumulación de CCNB1, lo que afecta los niveles umbral de actividad de CDK1, así como el momento de la reentrada meiótica.

a – d, g – j Ovocitos GV de ratones jóvenes y viejos (a – d) o Cpeb1+/+; ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/+) y Cpeb1fl/+; ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/−) (g – j) Se inyectaron mCherry poliadenilado y YFP-Ccnb1 3'-UTR (a, b, g, h) o YFP-Ccnb2 3-'UTR (c, d, i, j). Después de 3 h de preincubación, los ovocitos se mantuvieron en el estadio GV con tratamiento con cilostamida. Las señales de YFP y mCherry se registraron mediante microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos durante 15 h. Las señales de YFP se normalizaron por el nivel de las señales de mCherry. a, c, g, i La señal de YFP/mCherry en cada ovocito se representó gráficamente dependiendo del tiempo de incubación. b, d, h, j La tasa de traducción se calculó para cada ovocito mediante regresión lineal de los datos del informador entre 3 y 13 h. Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se muestran como la media \(\pm\) SEM. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, ns no significativa, ****P < 0,0001. e, f Expresión de la proteína CPEB1 en ovocitos CPEB1+/+ GV y ovocitos CPEB1+/− GV. Se utilizó como control la acumulación de α-tubulina. Los ovocitos se lisaron en tampón de muestra y se usaron para análisis de transferencia Western con 30 ovocitos por carril cargados para el experimento. e Se informa un representante de cuatro experimentos. f Un gráfico muestra la cuantificación de cuatro análisis de transferencia Western independientes. La barra representa la media \(\pm\) SD. Las proporciones CPEB1/α-tubulina se expresaron como cambios en veces sobre los ovocitos CPEB1+/+. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, **P = 0,0023. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

a, b Se incubaron ovocitos GV de ratones jóvenes y viejos (a), o ovocitos GV de Cpeb1+/+; ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/+) y Cpeb1fl/+; ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/−) (b) con cilostamida -Se capturaron imágenes libres de campo medio y claro cada 15 minutos. Se trazaron los tiempos GVBD acumulados. Los experimentos se repitieron al menos tres veces y los datos se muestran como la media \(\pm\) DE. Se utilizaron pruebas t de Student múltiples no apareadas de dos colas para evaluar la significación estadística en cada momento. a P = 0,00032 durante 30 min, P = 0,0076 durante 45 min, P = 0,016 durante 60 min. b P = 0,0036 durante 45 min, P = 0,0051 durante 60 min, P = 0,019 durante 75 min. La actividad c – f CDK1 se midió mediante ensayos de quinasa. Se incubaron ovocitos GV jóvenes y viejos (c, d), o ovocitos CPEB1+/+ y CPEB1+/− GV (e, f) con medio libre de cilostamida durante 45 minutos. Después de que los ovocitos se lisaron mediante congelación y descongelación, los ovocitos se incubaron con el fragmento GST-PP1 como sustrato durante 30 minutos. Los ovocitos se lisaron en un tampón de muestra y se utilizaron para análisis de transferencia Western. La fosforilación de T320 PP1 se detectó mediante un anticuerpo fosfoespecífico (pT320-PP1). El nivel de sustrato total cargado se evaluó mediante tinción Ponceau S (Total PP1). Para el experimento se cargaron diez ovocitos por carril. c, e Se informa un representante de los experimentos. d, f Un gráfico muestra la cuantificación de dos o tres análisis de transferencia Western independientes. Los datos se muestran como la media \(\pm\) SD. Las proporciones pT320-PP1/PP1 total se expresaron como cambios en veces respecto de los controles jóvenes. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas de dos colas para evaluar la significación estadística, d *P = 0,025, f *P = 0,033. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar si la haploinsuficiencia de CPEB1 recapitula los fenotipos asociados con el envejecimiento de los ovocitos, utilizamos ratones heterocigotos CPEB1 condicionales (Cpeb1fl/+;Zp3-Cre). La transferencia Western detectó una disminución del 50% en la proteína CPEB1 en ovocitos CPEB1+/− jóvenes en estado GV ​​(Fig. 5e, f). Esta disminución en la expresión de CPEB1 es comparable a la observada en ratones viejos (Fig. 4d, e). Para examinar si esta pérdida parcial de CPEB1 en ovocitos jóvenes recapitula los fenotipos asociados con el envejecimiento, examinamos la tasa de traducción de Ccnb1, el tiempo de GVBD y la actividad de CDK1 en este estado de reposo. Estas mediciones en ovocitos CPEB1 +/− muestran que la tasa de traducción del informador Ccnb1 aumenta en los ovocitos GV (Fig. 5g, h), mientras que no se observaron diferencias con el informador Ccnb2 (Fig. 5i, j). También se observó un tiempo de GVBD acelerado y un aumento de la actividad de CDK1 en los ovocitos CPEB1 +/- (Fig. 6b, e, f). Aunque las diferencias no son importantes, se observó un claro efecto dependiente de la dosis del gen al comparar heterocigotos y homocigotos nulos para el locus Cpeb1 (Figura complementaria 9a). Así, la manipulación genética de los niveles de CPEB1 en ovocitos jóvenes recapitula por completo todos los fenotipos que hemos descrito en ovocitos viejos.

Si la desrepresión de la traducción de Ccnb1 en ovocitos GV se debió exclusivamente a la disminución de los niveles de Cpeb1 detectados en ovocitos viejos, el aumento de la acumulación de proteína CPEB1 debería rescatar este fenotipo de traducción. Para probar esta posibilidad, se inyectaron ovocitos de GV con ARNm de Cpeb1 traducido in vitro junto con el indicador Ccnb1, y se midió la acumulación de YFP. Los experimentos de control en los que se midieron los niveles de proteína CPEB1 mediante transferencia Western indicaron un aumento en los niveles de proteína CPEB1 hasta el doble en comparación con el control (Fig. 7a, b). En estas condiciones, el aumento en la acumulación del indicador Ccnb1 en ovocitos viejos se revirtió mediante la coinyección con el ARNm de Cpeb1. La tasa de traducción en estos ovocitos coinyectados fue idéntica a la de los controles jóvenes y disminuyó significativamente en comparación con los controles viejos (Fig. 7c). Se observó un rescate similar de la desrepresión cuando a ovocitos jóvenes heterocigotos CPEB1 se les inyectó reportero y ARNm de Cpeb1 (Fig. 7d).

a, b Expresión de la proteína CPEB1 en ovocitos GV inyectados con ARNm de Cpeb1 en diferentes concentraciones. Como control se utilizó la acumulación de α-tubulina endógena. Los ovocitos se lisaron en un tampón de muestra y se utilizaron para análisis de transferencia Western. En total, se cargaron 30 ovocitos por carril para el experimento. b Un gráfico muestra la cuantificación de un único análisis de transferencia Western. Las proporciones CPEB1/α-tubulina se expresaron como cambios en veces con respecto al control. A los ovocitos c-f GV de ratones jóvenes y viejos, o ratones Cpeb1+/+;Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/+) y ratones Cpeb1fl/+;Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/−) se les inyectó mCherry poliadenilado, YFP-Ccnb1 3'-UTR. y ARNm de Cpeb1 (100 ng/μl). Después de la preincubación durante la noche, los ovocitos se mantuvieron en la etapa GV con tratamiento con cilostamida (c, d), o se liberaron en el medio libre de cilostamida para su maduración (e, f). Las señales de YFP y mCherry se registraron mediante microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos durante 20 h. Las señales de YFP se normalizaron por el nivel de las señales de mCherry. La tasa de traducción se calculó para cada ovocito mediante regresión lineal de los datos del informador. Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se muestran como la media \(\pm\) SEM. Se utilizó ANOVA unidireccional para evaluar la significación estadística, ns no significativo, c **P = 0,0076, ***P = 0,0002, d *P = 0,034, **P = 0,0015, e *P = 0,025, *** P = 0,0001, f **P = 0,0048, ****P < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Al reingresar a la meiosis, CPEB1 cambia su función de represor a activador de la traducción. Probamos si la traducción de Ccnb1 durante la maduración también se ve afectada con el envejecimiento materno, como hemos demostrado para Il7, Thumpd1 y Golph3 (Fig. 2f-k). La tasa de traducción del informador Ccnb1 disminuyó significativamente en los ovocitos viejos durante la maduración (Fig. 8a, e), mientras que no se observaron diferencias en Ccnb2 (Fig. 8b, f). También se detectó una disminución de la traducción del informador Ccnb1 en ovocitos jóvenes que portaban una haploinsuficiencia de CPEB1, sin cambios significativos en la traducción del informador Ccnb2 durante la maduración de los ovocitos (Fig. 8c, d, g, h). Tanto en ovocitos viejos como en ovocitos con haploinsuficiencia, la sobreexpresión de Cpeb1 rescató la disminución de la traducción del informador de Ccnb1 (Fig. 7e, f). Nuevamente, hubo un efecto de dosificación del gen Cpeb1 de CPEB1 en la traducción del informador Ccnb1 (Figura complementaria 9b). La traducción de los informadores Il7, Thumpd1 y Golph3 también disminuyó significativamente en los ovocitos CPEB1+/- durante la maduración (Fig. 9b – d, f – h), mientras que la traducción de Tpx2 se mantuvo sin cambios (Fig. 9a, e). Todos estos resultados son totalmente consistentes con el resultado de RNA-IP con anticuerpos CPEB1 (Figura complementaria 8). Por tanto, la disfunción de CPEB1 durante el envejecimiento materno también afecta la traducción durante la maduración.

Ovocitos GV de ratones jóvenes y viejos (a, b, e, f), o ovocitos GV de Cpeb1+/+; ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/+) y Cpeb1fl/+;Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/−) (c, d, g, h) se inyectaron con 12,5 ng/μl de mCherry poliadenilado y 12,5 ng/μl de YFP-Ccnb1 3'-UTR (a, c, e, g) o YFP-Ccnb2 3'-UTR (b, d, f, h ). Después de la preincubación durante la noche, los ovocitos se liberaron en el medio libre de cilostamida para su maduración. Las señales de YFP y mCherry se registraron mediante microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos durante 20 h. Las señales de YFP se normalizaron por el nivel de las señales de mCherry. La señal a – d YFP / mCherry en cada ovocito se representó dependiendo del tiempo de GVBD. La tasa de traducción e – h se calculó para cada ovocito mediante regresión lineal de los datos del informador entre 5 y 10 h (a, c) o entre 3 y 7 h (b, d). Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se muestran como la media \(\pm\) SEM. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, ns no significativa, ****P < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A los ovocitos GV de ratones Cpeb1+/+;Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/+) y Cpeb1fl/+;ratones Zp3Cre (ovocitos CPEB1+/−) se les inyectó mCherry poliadenilado y YFP-Tpx2 3'-UTR (a, e), YFP-Il7 3'-UTR (b, f), YFP-Thumpd1 3'-UTR (c, g) o YFP-Golph3 3'-UTR (d, h). Después de la preincubación durante la noche, los ovocitos se liberaron en el medio libre de cilostamida para su maduración. Las señales de YFP y mCherry se registraron mediante microscopía de lapso de tiempo cada 15 minutos durante 20 h. Las señales de YFP se normalizaron por el nivel de las señales de mCherry. La señal a – d YFP / mCherry en cada ovocito se representó dependiendo del tiempo de GVBD. La tasa de traducción e – h se calculó para cada ovocito mediante regresión lineal de los datos del informador entre 5 y 10 h (a, d) o entre 7 y 12 h después de GVBD (b, c). Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se muestran como la media \(\pm\) SEM. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, ns no significativo, *P = 0,017, **P = 0,0070, ****P < 0,0001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Anteriormente hemos demostrado que la disminución de la traducción de Ccnb1 provoca una mayor tasa de aneuploidía e infertilidad46. Dado que el cambio en el momento de la reentrada de la meiosis y la disminución de la traducción de Ccnb1 en los ovocitos causan infertilidad, probamos si una pérdida parcial en la expresión de CPEB1 en los ovocitos puede afectar la fertilidad al aparear ratones hembra CPEB1+/− con ratones macho de tipo salvaje. La desactivación condicional de CPEB1 después del nacimiento en ratones hembra conduce a una infertilidad completa15,49. Aunque no hubo diferencias en la cantidad de ovocitos recuperados (Fig. 10a), la tasa de maduración y el diámetro de los ovocitos entre los ratones CPEB1+/+ y CPEB1+/− (Fig. 10a-c complementaria), la fertilidad disminuyó significativamente 3 meses después del apareamiento. (Fig. 10b) y los ratones CPEB1+/− produjeron progresivamente significativamente menos crías en comparación con los ratones CPEB1+/+ (Fig. 10c). Los ratones CPEB1+/− también muestran una disminución en el número de embarazos (Fig. 10d). La edad del primer embarazo de ratones CPEB1+/+ y CPEB1+/− y el peso corporal de las crías fueron comparables (Figura complementaria 10d, e). Así, la haploinsuficiencia de Cpeb1 en ratones jóvenes provoca una disminución en la calidad de los ovocitos y recapitula algunos de los fenotipos asociados con la disfunción de CPEB1 en el envejecimiento materno.

a Cpeb1+/+; ratones Zp3Cre (ratones CPEB+/+) y Cpeb1fl/+; ratones Zp3Cre (ratones CPEB+/−) se cebaron con PMSG y los ovarios se diseccionaron 44 h después. Se contaron los ovocitos GV de cada par de ovarios. Los datos se presentan como diagramas de caja y bigotes. La línea central indica el valor mediano, mientras que el cuadro se refiere a los percentiles 25 al 75 y los bigotes marcan los valores mínimo y máximo. Se utilizaron pruebas t de Student no apareadas para evaluar la significación estadística, ns no significativa. b – d CPEB1+/+ y CPEB1+/− se aparearon ratones hembra con ratones macho WT. La reproducción se inició cuando los ratones alcanzaron al menos 8 semanas de edad. b Se registró el número acumulado de crías por hembra derivadas de ratones CPEB1+/+ y CPEB1+/−. Los datos se expresan como la media \(\pm\) DE. Se utilizaron pruebas t de Student múltiples no apareadas de dos colas para evaluar la significación estadística en cada momento. *P = 0,027 por 3 meses, *P = 0,030 por 4 meses, *P = 0,0052 por 5 meses, ***P = 0,00011 por 6 meses. c Se registró el número de crías por camada hasta tres embarazos y los datos se reportaron como diagramas de caja y bigotes. La línea central indica el valor mediano, mientras que el cuadro se refiere a los percentiles 25 al 75 y los bigotes marcan los valores mínimo y máximo. Entre paréntesis se incluye el número de camadas analizadas. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, *P = 0,030. d la frecuencia de partos se midió y se expresó como número de camadas por mes por hembra. Los datos se representan como diagramas de caja y bigotes. La línea central indica el valor mediano, mientras que el cuadro contiene los percentiles 25 al 75 y los bigotes marcan los valores mínimo y máximo. Se utilizaron pruebas t de Student de dos colas no pareadas para evaluar la significación estadística, ***P = 0,0008. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Utilizando diferentes enfoques complementarios, hemos determinado que el envejecimiento materno está asociado con una interrupción del programa de traducción del ARNm ejecutado durante la maduración de los ovocitos. Aproximadamente el 5% de los ARNm presentes en el ovocito se traducen incorrectamente durante la maduración. Aunque los cambios en la traducción no son profundos, proponemos que los efectos acumulativos de la traducción ineficiente y, en consecuencia, la proteostasis alterada tienen un impacto en la calidad de los ovocitos. Mecánicamente, documentamos que la traducción del ARNm que codifica una RBP crítica para la regulación de la traducción en el ovocito, CPEB1, se ve afectada, lo que resulta en una disminución de la acumulación de esta proteína. Esto, a su vez, da como resultado una traducción alterada en los ovocitos y una progresión aberrante a lo largo del ciclo celular meiótico. La asociación de CPEB1 con estos fenotipos detectados en ovocitos viejos se recapitula mediante un modelo de haploinsuficiencia de CPEB1 en el que se inducen reducciones similares en la proteína CPEB1 en ovocitos jóvenes. Además, el aumento de los niveles de CPEB1 en ovocitos viejos rescata estos fenotipos de traducción. Por lo tanto, creemos que la función alterada de CPEB1, que probablemente surja durante el crecimiento de los ovocitos, es el defecto molecular subyacente a algunos de los fenotipos asociados con la disminución de la aptitud de los ovocitos durante el envejecimiento materno. Junto con la disminución de la producción de ovocitos debido al agotamiento del folículo, la alteración de la síntesis de proteínas de novo dependiente de CPEB1 puede recapitular la disminución de la fertilidad observada con el envejecimiento.

Nuestros datos de RiboTag IP/RNA-Seq muestran una alteración en la carga de ribosomas en ovocitos viejos en comparación con ovocitos jóvenes. Aunque el poder de este análisis estuvo limitado por la disponibilidad de ovocitos viejos para análisis molecular, nuestros datos son internamente consistentes. Por ejemplo, el TE en los ovocitos jóvenes de control de este estudio está altamente correlacionado con el medido en otros conjuntos de datos que hemos generado14,15, así como con los datos de RNA-Seq sobre la traducción informados por otros50. Comparación entre nuestros datos y el traductor de Pan et al24. muestra efectos consistentes en algunos genes. Además, el análisis GO predice una alteración muy significativa en la traducción de los componentes necesarios para la biogénesis/función de las mitocondrias. La función defectuosa de las mitocondrias es una característica del envejecimiento37, y se ha informado de una traducción alterada de las proteínas mitocondriales. La predicción de una acetilación de proteínas asociada a ribosomas y una biogénesis de ribosomas también está respaldada por nuestro hallazgo de poliadenilación alterada del ARNm de Thumpd1 y traducción alterada de un reportero impulsado por la 3'-UTR de Thumpd1. Sin embargo, la comparación de nuestros datos con los reportados recientemente por otros27, desafortunadamente muestra poca o ninguna superposición, con la posible excepción de una disminución en la traducción de Sgk1. Aunque ese informe documentó la traducción alterada de 38 ARNm (FDR <0,1; 8 ARNm con FDR <0,05), detectamos defectos más generalizados que ascienden a 726 ARNm si se aplica el mismo límite (FDR <0,1, 256 ARNm con FDR <0,05). . El motivo de esta discrepancia no está claro actualmente. Cabe señalar que Del Llano et al.27 evaluaron la traducción inmediatamente después de la GVBD in vitro, un tiempo durante el cual la activación/represión de la traducción es mínimamente diferente de la de los ovocitos inactivos15. Por el contrario, evaluamos los cambios en la traducción en ovocitos MII madurados in vivo, cuando las diferencias en la traducción han alcanzado un máximo.

En conjunto, nuestros datos apuntan a una función defectuosa de CPEB1 como una de las causas moleculares de la traducción alterada. Esta conclusión se basa en (1) la traducción alterada del ARNm de Cpeb1 en los ovocitos y la disminución relacionada del 50 % en la proteína CPEB1; (2) Traducción defectuosa de los ARNm de Ccnb1, Il7 Thumpd1 y Golph3, que son todos objetivos auténticos de CPEB1; (3) Poliadenilación alterada de Ccnb1, Il7 Thumpd1 y Golph3; (4) Parámetros alterados de reentrada de ovocitos en el ciclo celular predichos por la regulación alterada de la síntesis de CCNB1; (5) Una acumulación defectuosa de CPEB1 en ovocitos jóvenes recapitula completamente la traducción y la progresión meiótica observada en ovocitos viejos, y el aumento de los niveles de proteína CPEB1 en ovocitos viejos rescata los fenotipos de traducción. Por lo tanto, nuestras conclusiones se basan en múltiples observaciones independientes, todas convergentes en la disfunción de CPEB1 durante el envejecimiento. Cabe señalar que, aunque algunos51 no lo detectan, otros han informado que el envejecimiento materno provoca una reentrada acelerada en el ciclo celular meiótico52,53, como hemos detallado aquí. Además, aunque los efectos detectados asociados con la haploinsuficiencia de Cpeb1 no son importantes, observamos consistentemente un efecto dependiente de la dosis del gen Cpeb1, lo que refuerza la validez de nuestras observaciones.

El análisis bioinformático de las propiedades de las transcripciones afectadas durante el envejecimiento indica que no todas las 3'-UTR asociadas contienen un CPE putativo. De las 126 3'-UTR analizadas, podemos identificar un supuesto CPE en 84, mientras que este elemento de acción cis no se detecta en 42 3'-UTR. Esto está documentado mediante el análisis del ARNm de Nlrp5. La traducción del ARNm endógeno de Nlrp5 aumenta en nuestro conjunto de datos y se detecta un aparente aumento de la transcripción en el transcriptoma envejecido depositado. Además, los datos del reportero muestran una represión defectuosa de la traducción de Nlrp5. La 3'-UTR de Nlrp5 no contiene elementos CPE discernibles y la Nlrp5 endógena no se inmunoprecipita en un ensayo RIP; por lo tanto, pueden alterarse mecanismos distintos de la traducción mediada por CPEB1. Del análisis de los ARNm que codifican las proteínas ribosomales mitocondriales también se deduce que no todos los transcritos afectados contienen un CPE. Estos hallazgos sugieren que la traducción de algunos ARNm se ve afectada indirectamente por un CPEB1 disfuncional o que eventos más complejos interrumpen la traducción de los ARNm maternos durante el envejecimiento. En este último escenario, un componente dependiente de CPEB1 actúa en paralelo con una alteración de otros circuitos reguladores que controlan la traducción. Las RBP involucradas, así como los mecanismos moleculares exactos implicados, requieren más investigación.

Dado el aumento de la traducción en los ovocitos GV seguido de una disminución de la tasa de traducción durante la maduración, calculamos que la activación general de la traducción del ARNm de Ccnb1 disminuye en un 50% en los ovocitos viejos. Esta disminución es sustancial y probablemente altera la progresión meiótica. Por ejemplo, encontramos que una disminución del 30% en la traducción del ARNm de Ccnb1 en la pérdida de función de Ccnb2 se asocia con un aumento significativo de la aneuploidía46. La unión cinetocoro-microtúbulos está regulada por la actividad de CDK1 y un cambio en la actividad de CDK1 conduce a cromosomas retrasados ​​en la anafase I54. Además, los estudios han informado que la aceleración farmacológica de la meiosis I causa una mayor tasa de aneuploidía55,56. Por lo tanto, el cambio en el momento de la reentrada de la meiosis y la activación alterada de CDK1 pueden estar relacionados con la aneuploidía descrita en ovocitos envejecidos.

La regulación postranscripcional que controla la traducción del ARNm de Cpeb1 no se ha investigado exhaustivamente. Sin embargo, CPEB1 se une a su propio ARNm (Figura 8 complementaria) y reprime su propia traducción en los ovocitos GV57. Además, se ha descrito un elemento que se une al factor de unión 1 rico en AU (AUF1), y se ha descrito una función para la modulación dependiente de microARN de Cpeb1 en células de neuroblastoma58. Por lo tanto, varios mecanismos posibles pueden estar causando una disminución de la traducción de Cpeb1 durante el crecimiento y la maduración de los ovocitos, mecanismos que requieren más investigación.

En conjunto, nuestros datos respaldan firmemente el concepto de que una interrupción en el programa de traducción en ovocitos de ratón está asociada con el envejecimiento materno. Además, proporcionamos evidencia de que una estequiometría alterada de la proteína CPEB1 puede ser uno de los defectos moleculares que causan una traducción alterada del ARNm materno en los ovocitos envejecidos. Además de ser consistente con otras observaciones, el hecho de que estos fenotipos puedan rescatarse mediante la sobreexpresión de CPEB1 y recapitularse mediante un modelo de haploinsuficiencia de Cpeb1 en ovocitos de mujeres jóvenes proporciona un apoyo convincente a nuestra hipótesis general. También cabe señalar que las deleciones heterocigotas del gen Cpeb1 en humanos se han asociado con insuficiencia ovárica prematura59,60,61,62, una opinión que respalda aún más los fenotipos dependientes de Cpeb1 durante el envejecimiento. Un modo de traducción dependiente de CPEB1 interrumpido puede no ser el único mecanismo, ya que la evidencia preliminar también sugiere la interrupción de un componente de traducción independiente de CPEB1. Se requieren más estudios para determinar cómo todos estos defectos en el programa de traducción convergen acumulativamente para alterar la calidad y la fertilidad de los ovocitos.

Cabe señalar que la traducción alterada es sólo uno de los componentes asociados al envejecimiento reproductivo. Aunque no es profunda, la disminución de la calidad de los ovocitos y la fertilidad en ratones jóvenes asociada con la haploinsuficiencia de Cpeb1 en un contexto de un número normal de ovocitos ovulados, probablemente se suma a la gran disminución en el número de folículos que maduran y el número de ovocitos ovulados durante el envejecimiento. Por lo tanto, proponemos que la disminución general de la fertilidad observada durante el envejecimiento es la suma o los efectos compuestos del número alterado de ovocitos producidos y su competencia de desarrollo defectuosa debido a la traducción alterada del ARNm materno.

Todos los procedimientos experimentales que involucran modelos animales utilizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California en San Francisco (AN182026-03A). Todos los animales utilizados eran de la cepa endogámica C57BL/6. Los ratones se alojaron en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad a una temperatura de 18 a 23 °C con un ambiente de 40 a 60 % de humedad. Los ratones jóvenes utilizados fueron hembras de 1 mes de edad, mientras que las hembras reproductoras retiradas de 12 a 15 meses de edad se consideraron ratones viejos. Los ratones C57BL/6-Zp3CreRpl22tm1.1Psam (RiboTagF/F;Zp3-Cre) se obtuvieron de Jackson Laboratories y se criaron como se describió anteriormente29. Los ratones dirigidos a CPEB1 fueron un regalo de la ref. 63 y C57BL/6-Cpeb1F/+;Zp3-Cre se criaron en nuestras instalaciones.

A ratones hembra se les inyectaron 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG; MyBioSource) para inducir el crecimiento del folículo y se sacrificaron 44 h después de la inyección. Se diseccionaron los ovarios y se recogieron AOC en medios que contenían medio esencial mínimo Eagle modificado con HEPES (Sigma-Aldrich, M2645) suplementado con piruvato de sodio 0,23 mM (Gibco, 11360070), penicilina-estreptomicina (Genesee Scientific Corporation (GenClone), 25 -512), y 3 mg/ml de BSA (Sigma-Aldrich, SIAL-A3311), bicarbonato de sodio 6 mM (JT-Baker, 3506-1) y un inhibidor de PDE (cilostamida 1 µM (Calbiochem, 231085) o 2 µM milrinona (Enzo ALK-270-083)). La aspiración a través de una pipeta de vidrio permitió la eliminación de las células del cúmulo circundantes. Los ovocitos desnudos se mantuvieron en la etapa GV en α-MEM (Gibco, 12561-056) suplementado con piruvato de sodio 0,23 mM, penicilina-estreptomicina y cilostamida 1 µM (o milrinona 2 µM) a 37 °C bajo 5% de CO2. Para la recolección de ovocitos MII in vivo, a ratones hembra se les inyectaron 5 UI de PMSG seguidos de 10 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG; Goldline Labs) 48 h después de la inyección de PMSG, y después de 13 h, se sacrificaron para la recuperación de ovocitos ovulados de la trompa de Falopio. tubos.

Para la inmunoprecipitación con RiboTag se utilizaron ovocitos de ratones hembra RiboTagF/F;Zp3-Cre estimulados con 5 UI de PMSG seguidos de 10 UI de hCG, u ovarios de ratones hembra RiboTagF/F;Zp3-Cre estimulados con 5 UI de PMSG. Los ovocitos se recogieron en 10 µl de 1 × PBS (Invitrogen, AM9625), suplementado con polivinilpirrolidona al 0,1% p/v (PVP; Sigma, P0930), ciclohexamida al 0,1% v/v (CHX; Sigma C7698) y 250 U de RNAseOUT ( Invitrogen 10777-019), luego se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Los ovarios se recogieron enteros, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Para preparar muestras para el IP, se lavó dos veces el volumen apropiado (80 µl por muestra) de Dynabeads™ Protein G (Invitrogen, 10004D) en 250 µl de tampón de homogeneización (HB: Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, KCl 100 mM, MgCl2 12 mM y NP-40 al 1% v/v) en un rotor a 4 °C durante 5 min por lavado. Se realizaron dos lavados adicionales con 250 µl de HB suplementado (sHB: HB suplementado con DTT 1 mM (sigma 646563), 1 × inhibidor de proteasa HALT (Fisher P178441), 200 unidades/ml de RNaseOUT, 200 unidades/ml de RNasin (Promega N2115), 100 µg/ml CHX) en un rotor a 4 °C durante 5 min por lavado. Después del lavado final, las perlas se eluyeron nuevamente al volumen original con sHB. Las muestras de ovocitos se descongelaron y se combinaron para producir un total de 200 ovocitos por réplica, y se agregaron 300 µl de sHB a cada muestra combinada. Para lisar las células, las muestras se agitaron durante 30 segundos y los homogeneizados se centrifugaron durante 15 minutos a 20.817 xg a 4 °C. Los ovarios se homogeneizaron en 300 µl de sHB y se centrifugaron igualmente. Para aclarar previamente las muestras, los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos, se agregaron 20 µl de perlas lavadas a cada sobrenadante y las muestras se incubaron en un rotor a 4 °C durante 30 minutos. Se utilizó una rejilla magnética para retirar las perlas y se recogieron 30 µl (10 %) de cada lisado previamente aclarado y se agregaron a 250 µl de tampón RLT (Qiagen, 74034) suplementado con DTT 1 mM para que sirviera como muestra de entrada. Las muestras de entrada se congelaron y se mantuvieron a -80 °C hasta la extracción del ARN. En total, se agregaron 4 µl (4 µg) de anticuerpo anti-etiqueta de epítopo HA.11 (1/75, Invitrogen, 26183) a cada uno de los extractos y todas las muestras se incubaron en un rotor a 4 °C durante 4 h. Se agregaron treinta microlitros de perlas lavadas a las muestras y se incubaron durante la noche en un rotor a 4 °C. Las perlas (ahora unidas por ribosomas marcados con HA y los ARNm asociados) se lavaron cuatro veces en 750 µl de tampón de lavado de urea (uWB: Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl2 12 mM, NP al 1 % v/v). -40, 1 × inhibidores de proteasa, DTT 1 mM, 40 U RNaseOUT, 40 U RNasin, 100 µg/ml de cicloheximida y 1 M de urea) en un rotor a 4 °C durante 10 minutos por lavado. Luego se transfirió la suspensión de perlas a tubos nuevos, se granuló mediante una rejilla magnética y se eliminó el uWB. Para eliminar el complejo de ARNm de las perlas, se agregaron a cada muestra 250 µl de tampón RLT suplementado con DTT y las muestras se agitaron durante 30 s. Finalmente, las perlas se sedimentaron y retiraron antes de realizar la extracción de ARN utilizando el microkit Rneasy Plus (Qiagen, 74034). Las muestras se eluyeron en 14 µl de agua libre de RNasa y se usaron aguas abajo para el análisis RNA-Seq o RT-qPCR.

Las muestras de ARN de RiboTag se enviaron al Centro de Genómica de los Institutos Gladstone para el control de calidad utilizando el Bioanalizador (Agilent) y la preparación de la biblioteca de ADNc. El ADNc se preparó con el kit Ovation RNA-Seq System V2 (NuGEN, 7102), que utiliza una combinación patentada de enzimas y cebadores para cebar preferentemente secuencias que no son de ARNr. La síntesis de ADNc de primera cadena se logra con cebadores hexámeros aleatorios y cebadores poli(T) quiméricos, que se unen a la región que abarca el extremo de la 3'-UTR y el inicio de la cola poli(A). Debido a que los ARNm estables tienen al menos 20 residuos de adenosina, el uso de estos cebadores poli(T) quiméricos permite el cebado preferencial de mensajes adenilados (ARNm) con un sesgo mínimo para mensajes con colas poli(A) más largas. Las bibliotecas de RNA-Seq se construyeron utilizando Ovation Ultralow System V2 (NuGEN, 0344) y se analizaron mediante Bioanalyzer, se cuantificaron mediante qPCR (Kapa Biosystems, KR0405) y se secuenciaron utilizando el sistema HiSeq 4000 (Illumina).

La calidad de los datos de la secuencia sin procesar se verificó mediante FASTQC. Luego, los archivos de secuencia se recortaron utilizando herramientas en Trimmomatic 0.3664. Se eliminaron lo siguiente: secuencias de adaptadores de un solo extremo de Illumina TruSeq3, bases con una puntuación de calidad <3 al inicio y al final de una lectura, bases que tenían una calidad promedio por base de <15 calculada usando una ventana deslizante para promediar cuatro bases, y cualquier lectura que fuera inferior a 36 bases. Las lecturas eran de un solo extremo y las calidades eran caracteres ASCII iguales a la calidad de Phred más 33.

HiSat265 se utilizó para crear índices a partir del Reference Consortium Mouse Build 38 (mm10) y para alinear las lecturas de secuencia con el genoma. Los archivos .bam resultantes se ordenaron e indexaron con SAMtools66. Los archivos de recuento para cada grupo se crearon con HTSeq utilizando el ratón GENCODE Gene set versión M11. Los datos de entrada eran archivos.bam, los datos no provenían de un ensayo específico de cadena y el tipo de característica utilizada fue "gen".

Para los análisis estadísticos se utilizaron los paquetes Bioconductor edgeR67 y limma68. Solo se mantuvieron lecturas con 10 conteos por millón de lecturas (CPM) mayores o iguales en al menos dos muestras. Luego, la normalización de la media recortada de los valores M (TMM), que tiene en cuenta las diferencias de composición entre las bibliotecas, se realizó en lecturas de HA y lecturas de entrada, por separado. Utilizando los recuentos brutos, la dispersión y la matriz de diseño, se ajustó el modelo lineal generalizado binomial negativo para cada gen. Finalmente, se realizaron pruebas de razón de probabilidad por pares para jóvenes versus mayores. La eficiencia de traducción se calculó utilizando la relación entre la cantidad de ARNm recuperado en el sedimento de RiboTag (HA-IP) sobre el ARNm total presente en el ovocito (entrada).

Las listas de genes se cargaron en DAVID 6.869,70 y se procesaron con la herramienta de anotación funcional.

El volumen apropiado (80 µl por muestra) de Dynabeads™ Protein G se lavó dos veces en 250 µl de tampón de lisis incompleta (iLB: Tris-HCl 30 mM, pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl2 10 mM, NP-40 0,5 % v/v). , Na3VO4 0,25 mM y β-glicerofosfato 10 mM) en un rotor a 4 °C durante 5 minutos por lavado. Se realizaron dos lavados adicionales con 250 µl de LB completo (cLB: iLB suplementado con 5 × inhibidor de proteasa HALT, DTT 1 mM, 80 U/ml de RNAseOUT, 80 U/ml de RNasin y 2 × complejo de ribonucleósido vanadilo) en un rotor a 4 °. C durante 5 min por lavado. Se eliminó la solución de lavado final y las perlas se eluyeron hasta el volumen original con cLB. Se recogieron doscientos ovocitos GV de tipo salvaje en 10 µl de PVP al 0,1% p/v y 250 U de RNAseOUT en 1 × PBS, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Para homogeneizar las células, se agregaron 300 µl de cLB, las muestras se agitaron durante 30 segundos y luego se incubaron en hielo durante 10 minutos. Luego, los homogeneizados se centrifugaron durante 15 minutos a 20.817 x g a 4 °C y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. En total, se guardaron 30 µl (10%) de cada sobrenadante en 250 µl de tampón RLT suplementado con DTT 1 mM como muestras de entrada y el volumen restante se dividió en partes iguales entre CPEB1-IP y IgG-IP (control). El volumen de cada muestra se aumentó a 300 µl con cLB, se agregaron a cada tubo 4 µl (4 µg) del anticuerpo apropiado (1/75, anti-CPEB1: Abcam, ab73287 e IgG de control: Millipore, 12-371). , y las muestras se incubaron en un rotor durante 4 h a 4 °C. Luego se agregaron treinta microlitros de perlas lavadas a cada tubo y las muestras se incubaron en un rotor durante la noche a 4 °C. Las perlas de cada muestra se sedimentaron utilizando una rejilla magnética y se lavaron 4 veces en un rotor a 4 °C con 750 µl de tampón de lavado (WB: Tris-HCl 30 mM, pH 7,4, KCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 0,5% v/ v NP-40, Na3VO4 0,25 mM, β-glicerofosfato 10 mM, 1 × inhibidor de proteasa HALT, DTT 1 mM, urea 1 M, RNaseOUT 50 U/ml y RNasin 50 U/ml) durante 10 minutos por lavado. Después de cada lavado, se sedimentaron las perlas y se eliminó el WB. Las muestras se transfirieron a un tubo limpio y se agregaron a cada muestra 250 µl de tampón RLT suplementado con DTT 1 mM. Las muestras se agitaron durante 30 s, las perlas se sedimentaron y se retiraron. La extracción de ARN se realizó siguiendo el protocolo Qiagen Rneasy Plus Micro Kit. Las muestras se eluyeron en 14 µl de agua libre de RNasa y se usaron para análisis RT-qPCR posteriores.

El ARN extraído se transcribió de forma inversa utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScriptTM III con cebadores hexámeros aleatorios u oligo dT (Invitrogen, 18080-051). La expresión genética se midió utilizando ensayos TaqManTM y TaqmanTM Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher, 4444557). Los ensayos TaqMan utilizados fueron los siguientes; ActB (Mm02619580_g1), Ccnb1 (Mm03053893_gH), Ccnb2 (Mm01171453_m1), Cpeb1 (Mm01314928_m1), Dppa3 (Mm01184198_g1), Eif4a1 (Mm03807704_g1), Gata4 (Mm0). 0484689_m1), Golf3 (Mm00499420_m1), Il7 (Mm01295803_m1), Nlrp5 (Mm01143609_m1), Thumpd1 (Mm00524010_m1), Tpx2 (Mm01245970_m1), Sirt1 (Mm01168521_m1), Sirt7 (Mm01248607_m1), Rpl19 (Mm02601633_g1) y Zp3 (Mm00442176_m1). Se realizaron qPCR preliminares para probar los niveles de ARNm que no cambiaron en los ovocitos GV y MII. Entre los genes probados, Actb y Eif4a1 se expresaron en niveles similares en GV y MII cuando se usaron hexámeros aleatorios para el cebado de RT, mientras que Dppa3 y Rpl19 se mantuvieron estables cuando se usaron oligo(-dT). Dado que no se encontró que ningún gen fuera estable con ambas condiciones de cebado, utilizamos la media geométrica de los cuatro mejores candidatos para las dos condiciones de cebado, y no se observaron diferencias en los valores de Ct ni para la etapa meiótica ni para el método de cebado (N = 6; ANOVA unidireccional emparejado). Por lo tanto, en todos los experimentos que utilizaron qPCR se utilizó la media geométrica de Actb, Eif4a1, Dppa3 y Rpl19 Ct para la normalización de datos. Se realizaron reacciones de diez microlitros en el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems). La expresión génica se cuantificó mediante el método 2-Ct y el análisis estadístico se realizó mediante GraphPad Prism 8.

Las secuencias de marco de lectura abierto Ccnb1, Ccnb2, Golph3, Il7, Nlrp5, Thumpd1 y Tpx2 3'-UTR y Cpeb1 (Datos complementarios 3) se obtuvieron mediante amplificación de ARNm de ovocitos con cebadores apropiados (Datos complementarios 4). Los reporteros YFP, mCherry y FL se subclonaron en el vector pcDNA 3.1 y los reporteros RL se prepararon en el vector pRL-TK; ambos contienen un promotor T7 que permite la transcripción in vitro para sintetizar ARNm, y la fidelidad se confirmó mediante secuenciación de ADN. Todos los reporteros incluyeron un tramo de 20A al final de 3'. El reportero mCherry estaba poliadenilado in vitro y contenía una cola poli (A) de 150–200 A. Los reporteros de ARNm se transcribieron in vitro para sintetizar ARNm con el kit de transcripción mMESSAGE mMACHINE T7 (Ambion, AM1344); La poliadenilación de mCherry y Firefly luciferasa se obtuvo utilizando el kit Poly(A) Tailing (Ambion, AM1350). Todos los mensajes se purificaron utilizando el kit MEGAclear (Ambion, AM1908). Las concentraciones de ARNm se midieron mediante NanoDrop y su integridad se evaluó mediante electroforesis.

A los ovocitos todavía encerrados en las células del cúmulo (CEO) se les inyectaron 12,5 ng/μl de Il7-RL, Thumpd1-RL o Tpx2-RL y 12,5 ng/μl de FL poliadenilado usando un microinyector programable FemtoJet Express con un sistema de microscopio vertical automatizado ( Leica, DM4000B). Los CEO inyectados se preincubaron durante 3 h en medio de cultivo suplementado con milrinona 2 μM y luego se cultivaron en medio libre de milrinona suplementado con anfirregulina 100 nM. Después de 16 h, se desnudaron los CEO, se recogieron en tampón de lisis y se congelaron. Las actividades de luciferasa en los extractos de ovocitos se midieron utilizando un kit de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega) y la luminiscencia se detectó con un luminómetro SpectraMax L (Molecular Devices). Los datos se presentan como proporciones de RL y FL.

Se inyectaron Ccnb1-YFP, Ccnb2-YFP, Il7-YFP, Golph3-YFP, Thumpd1-YFP o Tpx2-YFP en ovocitos a 12,5 ng/μl con mCherry poliadenilado a 12,5 μg/μl usando un microinyector programable FemtoJet Express con un Sistema de microscopio vertical. Después de una preincubación de 3 h o durante la noche en medio α-MEM con cilostamida 1 µM, los ovocitos se liberaron en medio libre de cilostamida para la maduración in vitro o se incubaron con cilostamida para mantener el estado GV. Las grabaciones de lapso de tiempo se realizaron utilizando una Nikon Eclipse T2000-E equipada con un escenario móvil y una cámara ambiental de 37 °C y 5% de CO2 con las siguientes configuraciones: juego de filtros, espejo dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal Ypet (Ej: S500/20×49057 Em: D535/30 m 47281); y canal mCherry (Ej: 580/25×49829 Em: 632/60 m). Las imágenes se procesaron y la fluorescencia se cuantificó utilizando MetaMorph (Molecular Devices). Las proporciones del indicador YFP del nivel estancado de la señal de mCherry se informaron como la acumulación de proteínas durante la maduración de los ovocitos. La tasa de traducción se calculó con las proporciones YFP/mCherry como la pendiente de la curva de regresión lineal simple en el intervalo de tiempo indicado.

Los ovocitos se recogieron en 30 µl de tampón quinasa 2X (HEPES 100 mM, MgCl2 30 mM, EGTA 2 mM, CaCl2 10 mM, DTT 2 mM, leupeptina 2 µg/ml, aprotinina 2 µg/ml, ácido okadaico 2 µM). Los ovocitos se lisaron congelando y descongelando dos veces en nitrógeno líquido. Los extractos se incubaron a 30 °C durante 30 minutos en presencia de ATP 0,1 mM, DTT 10 mM, ácido okadaico 2 µM y 2 µg de péptido recombinante GST-PP1 como sustrato. PP1-GST se produjo como se describió anteriormente47. Las reacciones se detuvieron añadiendo tampón de muestra Laemmli y hirviendo a 95 °C durante 5 min. La actividad de CDK1 se midió cuantificando la señal de transferencia Western de T320 fosforilada del sustrato total cargado evaluado mediante tinción con Ponceau S.

Los ovocitos se lisaron en 10 µl de PBS/PVP al 0,1% p/v con 4 µl de tampón Laemmli (Bio-Rad, 161-0747) con β-mercaptoetanol (Gibco 21985023), un inhibidor de fosfatasa y un inhibidor de proteasa. Los lisados ​​de ovocitos se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C y se dejaron en hielo, luego se separaron en geles de poliacrilamida al 10 % v/vo 12 % v/v y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore ISEQ00010). Las membranas se bloquearon en leche al 5% p/v durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. El anticuerpo primario y las diluciones utilizadas fueron las siguientes: CPEB1 (Abcam, ab73287, 1:1000), α-tubulina (Sigma-Aldrich, T6074, 1:10,000), T320-pp1 (Abcam, ab62334, 1:30,000). Las membranas se lavaron en TBS-Tween 20 (0,05% v/v) y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, IgG anti-conejo 1:10.000 (GE Healthcare, NA934V) e IgG anti-ratón 1:10.000 (GE Healthcare NA931V). , durante 2 h a temperatura ambiente. Las señales se detectaron utilizando el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad, 170-5061). Las imágenes se analizan con el ImageJ 1.53a.

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete GraphPad Prism 9.3.1. El análisis estadístico realizado dependió de un experimento específico y se describe en la leyenda de la figura. Para la comparación entre dos grupos, se utilizó una prueba t de dos colas, pareada o no pareada; para la comparación múltiple, se utilizó ANOVA de una vía. La significancia estadística se indica con un asterisco en cada gráfico. La calidad de las lecturas de RNA-Seq se realizó utilizando FastQC y luego las lecturas se recortaron con Trimmomatic 0.36. Hisat2 realizó la alineación de las lecturas con el genoma del ratón, los archivos .bam se ordenaron e indexaron utilizando Samtools y los archivos de recuento se generaron mediante HTSeq. La normalización de TMM y los análisis estadísticos restantes de RNA-Seq se realizaron a través de edgeR.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RiboTag-IP/RNA-Seq se han depositado en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con el código de acceso GSE222638. Los conjuntos de datos publicados disponibles utilizados en este trabajo fueron del número de acceso GDS3295 del NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE11667] (Aging transcriptome24 ), GSE35106 (matriz de polisomas14), GSE135525 (RiboTag IP/RNA-Seq15), GSE165782 (PAIso-seq71) y GRCm38 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001635.20] (ratón conjunto de datos del genoma). Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36396-1

Fedarko, NS La biología del envejecimiento y la fragilidad. Clínico. Geriatría. Medicina. 27, 27–37 (2011).

Artículo de Google Scholar

Klein, J. & Sauer, MV Evaluación de la fertilidad en mujeres en edad reproductiva avanzada. Soy. J. Obstet. Ginecol. 185, 758–770 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Navot, D. et al. La mala calidad de los ovocitos, más que el fallo de implantación, es la causa de la disminución de la fertilidad femenina relacionada con la edad. Lanceta 337, 1375-1377 (1991).

Artículo CAS Google Scholar

Sauer, MV El impacto de la edad en el potencial reproductivo: lecciones aprendidas de la donación de ovocitos. Maturitas 30, 221–225 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Jones, KT y Lane, SI Causas moleculares de aneuploidía en huevos de mamíferos. Desarrollo 140, 3719–3730 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Hassold, T. & Hunt, P. Edad materna y embarazos con anomalías cromosómicas: lo que sabemos y lo que desearíamos saber. actual. Opinión. Pediatra. 21, 703–708 (2009).

Artículo de Google Scholar

Titus, S., Stobezki, R. y Oktay, K. Reparación deteriorada del ADN como mecanismo para el envejecimiento de los ovocitos: ¿está determinada epigenéticamente? Semin Reproducción. Medicina 33, 384–388 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Gosden, R. y Lee, B. Retrato de un ovocito: nuestro oscuro origen. J.Clin. Invertir. 120, 973–983 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Eppig, JJ Coordinación de la maduración de ovocitos nucleares y citoplasmáticos en mamíferos euterios. Reproducción. Fértil. Desarrollo. 8, 485–489 (1996).

Artículo CAS Google Scholar

Combelles, CM, Cekleniak, NA, Racowsky, C. y Albertini, DF Evaluación de la maduración nuclear y citoplasmática en ovocitos humanos madurados in vitro. Tararear. Reproducción. 17, 1006–1016 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Li, R. & Albertini, DF El camino hacia la maduración: interacción de células somáticas y autoorganización del ovocito de mamífero. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 14, 141-152 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Bianchi, S. y col. Los marcadores ultraestructurales de calidad están alterados en ovocitos humanos envejecidos en metafase II: una comparación entre el envejecimiento reproductivo y el in vitro. J. Asistencia a la reproducción. Gineta. 32, 1343-1358 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Clarke, HJ Control postranscripcional de la expresión génica durante la oogénesis del ratón. Problema de resultados. Diferencia de celda. 55, 1-21 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Chen, J. y col. El análisis de la traducción de todo el genoma revela un papel fundamental para la eliminación de tipo azoospermia (Dazl) en la transición de ovocito a cigoto. Desarrollo de genes. 25, 755–766 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Luong, XG, Daldello, EM, Rajkovic, G., Yang, CR y Conti, M. El análisis de todo el genoma revela un cambio en el programa traslacional tras la reanudación meiótica de los ovocitos. Ácidos nucleicos res. 48, 3257–3276 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Yartseva, V. & Giraldez, AJ La transición materna a cigótica durante el desarrollo de los vertebrados: un modelo para la reprogramación. actual. Arriba. Desarrollo. Biol. 113, 191–232 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Chen, J. y col. Las células somáticas regulan la traducción del ARNm materno y la competencia de desarrollo de los ovocitos de ratón. Nat. Biol celular. 15, 1415-1423 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Franciosi, F., Manandhar, S. & Conti, M. La FSH regula la traducción del ARNm en ovocitos de ratón y promueve la competencia del desarrollo. Endocrinología 157, 872–882 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Conti, M. & Franciosi, F. Adquisición de la competencia de los ovocitos para desarrollarse como embrión: eventos nucleares y citoplasmáticos integrados. Tararear. Reproducción. Actualización 24, 245–266 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Richter, JD CPEB: una vida en traducción. Tendencias Bioquímica Ciencia. 32, 279–285 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Piqué, M., López, JM, Foissac, S., Guigo, R. y Méndez, R. Un código combinatorio para el control traslacional mediado por CPE. Celda 132, 434–448 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Grondahl, ML et al. Perfiles de expresión genética de ovocitos maduros humanos individuales en relación con la edad. Tararear. Reproducción. 25, 957–968 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Hamatani, T. y col. Alteración asociada a la edad de los patrones de expresión génica en ovocitos de ratón. Tararear. Mol. Gineta. 13, 2263–2278 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Pan, H., Ma, P., Zhu, W. y Schultz, RM Aumento de la aneuploidía asociado a la edad y cambios en la expresión genética en huevos de ratón. Desarrollo. Biol. 316, 397–407 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Steuerwald, NM, Bermudez, MG, Wells, D., Munne, S. y Cohen, J. Perfiles de expresión global diferenciales relacionados con la edad materna observados en ovocitos humanos. Reproducción. Biomédica. En línea 14, 700–708 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

de Vantery, C., Stutz, A., Vassalli, JD y Schorderet-Slatkine, S. La adquisición de competencia meiótica en ovocitos de ratón en crecimiento se controla tanto a nivel traslacional como postraduccional. Desarrollo. Biol. 187, 43–54 (1997).

Artículo de Google Scholar

Del Llano, E. et al. Diferencias relacionadas con la edad en el panorama traslacional de los ovocitos de mamíferos. Envejecimiento celular 19, e13231 (2020).

Artículo de Google Scholar

Sanz, E. et al. Aislamiento específico de tipo celular de ARNm asociado a ribosomas de tejidos complejos. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 106, 13939–13944 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Sousa Martins, JP et al. DAZL y CPEB1 regulan la traducción del ARNm de forma sinérgica durante la maduración de los ovocitos. J. Ciencia celular. 129, 1271-1282 (2016).

Google Académico

Sha, QQ y cols. Dinámica y relevancia clínica de la eliminación del ARNm materno durante la transición de ovocito a embrión en humanos. Nat. Comunitario. 11, 4917 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Zhang, C., Wang, M., Li, Y. y Zhang, Y. Perfiles y caracterización funcional de la traducción del ARNm materno durante la transición materno-cigótica del ratón. Ciencia. Adv. 8, eabj3967 (2022).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hu, W. y col. El transcriptoma unicelular y el translatomo dual-ómico revelan mecanismos potenciales de maduración de ovocitos humanos. Nat. Comunitario. 13, 5114 (2022).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Tharakan, R., Ubaida-Mohien, C., Piao, Y., Gorospe, M. y Ferrucci, L. El análisis del perfil de ribosomas del músculo esquelético humano identifica una traducción reducida de proteínas mitocondriales con la edad. Biol de ARN. 18, 1555-1559 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Anisimova, AS et al. Desregulación multifacética de la expresión genética y la síntesis de proteínas con la edad. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 117, 15581–15590 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

van Heesch, S. et al. El paisaje traslacional del corazón humano. Celda 178, 242–260 e229 (2019).

Artículo de Google Scholar

Jang, JY, Blum, A., Liu, J. y Finkel, T. El papel de las mitocondrias en el envejecimiento. J.Clin. Invertir. 128, 3662–3670 (2018).

Artículo de Google Scholar

van der Reest, J., Nardini Cecchino, G., Haigis, MC y Kordowitzki, P. Mitocondrias: su relevancia durante el envejecimiento de los ovocitos. Envejecimiento Res Rev. 70, 101378 (2021).

Artículo de Google Scholar

Li, L., Baibakov, B. y Dean, J. Un complejo materno subcortical esencial para la embriogénesis del ratón antes de la implantación. Desarrollo. Celda 15, 416–425 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Racedo, SE, Rawe, VY y Niemann, H. Cambios dinámicos del aparato de Golgi durante la maduración de ovocitos bovinos in vitro. Reproducción 143, 439–447 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Sas-Chen, A. et al. Acetilación dinámica de ARN revelada mediante mapeo evolutivo cruzado cuantitativo. Naturaleza 583, 638–643 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Cakmak, H., Franciosi, F., Zamah, AM, Cedars, MI y Conti, M. La secreción dinámica durante la reentrada meiótica integra la función de los ovocitos y las células del cúmulo. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 113, 2424–2429 (2016).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Costermans, NGJ, Daldello, EM, Marathe, RJ y Conti, M. Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un ensayo de indicador de ovocito único. J. Vis. Exp. 172, e62041 (2021).

Yu, C. y col. BTG4 es un factor de licencia de transición materno-cigótico acoplado al ciclo celular meiótico en los ovocitos. Nat. Estructura. Mol. Biol. 23, 387–394 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Ingolia, NT, Ghaemmaghami, S., Newman, JR y Weissman, JS Análisis de todo el genoma in vivo de la traducción con resolución de nucleótidos mediante perfiles de ribosomas. Ciencia 324, 218–223 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Han, SJ y cols. La traducción de ciclina B1 y B2 se regula diferencialmente durante la reentrada de ovocitos de ratón en el ciclo celular meiótico. Ciencia. Rep. 7, 14077 (2017).

ADS del artículo Google Scholar

Daldello, EM, Luong, XG, Yang, CR, Kuhn, J. & Conti, M. La ciclina B2 es necesaria para la progresión a través de la meiosis en ovocitos de ratón. Desarrollo 146, dev172734 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Daldello, EM et al. El control de la acumulación de Cdc6 por Cdk1 y MAPK es esencial para completar las divisiones meióticas de los ovocitos en Xenopus. J. Ciencia celular. 128, 2482–2496 (2015).

CAS Google Académico

Lewis, CW y cols. Un ensayo de transferencia Western para medir la actividad de la quinasa dependiente de ciclina en células o in vitro sin el uso de radioisótopos. FEBS Lett. 587, 3089–3095 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Racki, WJ & Richter, JD CPEB controla el crecimiento de ovocitos y el desarrollo de folículos en el ratón. Desarrollo 133, 4527–4537 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Sha, QQ y cols. Una cascada MAPK combina la traducción y degradación del ARNm materno con la progresión del ciclo celular meiótico en ovocitos de ratón. Desarrollo 144, 452–463 (2017).

CAS Google Académico

Duncan, FE, Chiang, T., Schultz, RM y Lampson, MA Evidencia de que un punto de control defectuoso del conjunto del huso no es la causa principal de aneuploidía materna asociada a la edad en huevos de ratón. Biol. Reproducción. 81, 768–776 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Yamamoto, T. y col. Efecto de la edad materna sobre la competencia del desarrollo y la progresión de la maduración nuclear en ovocitos bovinos. Mol. Reproducción. Desarrollo. 77, 595–604 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Koncicka, M. y col. El aumento de la expresión de los componentes del factor promotor de la maduración acelera la meiosis en los ovocitos de mujeres de edad avanzada. En t. J. Mol. Ciencia. 19, 2841 (2018).

Artículo de Google Scholar

Davydenko, O., Schultz, RM y Lampson, MA El aumento de la actividad de CDK1 determina el momento de las uniones cinetocoro-microtúbulos en la meiosis IJ Cell Biol. 202, 221–229 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Dong, F. y col. La inhibición de las quinasas CDK4/6 provoca la producción de ovocitos aneuploides al inactivar el punto de control del ensamblaje del huso y acelerar la primera progresión meiótica. Biochim Biophys. Acta Mol. Resolución celular. 1868, 119044 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Lane, SI, Chang, HY, Jennings, PC y Jones, KT El inhibidor de la quinasa Aurora ZM447439 acelera la primera meiosis en ovocitos de ratón al anular el punto de control del ensamblaje del huso. Reproducción 140, 521–530 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Dai, XX y col. Un código combinatorio para el control traduccional mediado por ARNm 3'-UTR en el ovocito de ratón. Ácidos nucleicos res. 47, 328–340 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Oe, S. y col. La expresión de Cpeb1 está regulada postranscripcionalmente por AUF1, CPEB1 y microARN. FEBS Open Bio 12, 82–94 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Bestetti, I. et al. El análisis de matriz CGH de alta resolución en pacientes 46,XX afectadas por insuficiencia ovárica primaria de aparición temprana revela nuevos genes implicados en la función ovárica. Tararear. Reproducción. 34, 574–583 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Hyon, C. y col. Deleción del gen CPEB1: una causa rara pero recurrente de insuficiencia ovárica prematura. J.Clin. Endocrinol. Metab. 101, 2099–2104 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

McGuire, MM y cols. El análisis genómico utilizando matrices de polimorfismos de un solo nucleótido de alta resolución revela nuevas microdeleciones asociadas con insuficiencia ovárica prematura. Fértil. Estéril. 95, 1595-1600 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Tsuiko, O. y col. El análisis de variación del número de copias detecta nuevos genes candidatos implicados en el crecimiento folicular y la maduración de ovocitos en una cohorte de casos de insuficiencia ovárica prematura. Tararear. Reproducción. 31, 1913-1925 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Calderón, V. et al. Las funciones secuenciales de CPEB1 y CPEB4 regulan la expresión patológica del factor de crecimiento endotelial vascular y la angiogénesis en la enfermedad hepática crónica. Gastroenterología 150, 982–997 e930 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: un recortador flexible para datos de secuencia de Illumina. Bioinformática 30, 2114-2120 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Kim, D., Langmead, B. & Salzberg, SL HISAT: un alineador empalmado rápido con bajos requisitos de memoria. Nat. Métodos 12, 357–360 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Li, H. y col. La secuencia Alineación/Formato de mapa y SAMtools. Bioinformática 25, 2078–2079 (2009).

Artículo de Google Scholar

Robinson, MD, McCarthy, DJ y Smyth, GK edgeR: un paquete de bioconductores para el análisis de expresión diferencial de datos de expresión génica digital. Bioinformática 26, 139-140 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Ritchie, ME y cols. limma potencia los análisis de expresión diferencial para estudios de microarrays y secuenciación de ARN. Ácidos nucleicos res. 43, e47 (2015).

Artículo de Google Scholar

Huang da, W., Sherman, BT y Lempicki, RA Análisis sistemático e integrador de grandes listas de genes utilizando recursos bioinformáticos de DAVID. Nat. Protocolo. 4, 44–57 (2009).

Artículo de Google Scholar

Huang da, W., Sherman, BT y Lempicki, RA Herramientas de enriquecimiento bioinformático: caminos hacia el análisis funcional integral de grandes listas de genes. Ácidos nucleicos res. 37, 1-13 (2009).

Artículo de Google Scholar

Xiong, Z. y col. Ribo-seq ultrasensible revela paisajes traslacionales durante la transición de ovocito a embrión de mamíferos y el desarrollo previo a la implantación. Nat. Biol celular. 24, 968–980 (2022).

Artículo MathSciNet CAS Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos al Dr. Raúl Méndez y al Dr. Gonzalo Fernández-Miranda (Instituto de Ciencia y Tecnología de Barcelona) por compartir los ratones dirigidos a CPEB1, y al Dr. Chisato Kunitomi y Hong Kung Li por la recolección de muestras. Este trabajo fue apoyado por el Centro NIH/NICHD P50 HD055764 de Investigación, Innovación y Capacitación en Reproducción e Infertilidad, el NIH R01 GM116926. Este proyecto fue financiado en parte por la subvención número GCRLE-1020 del Consorcio Global para la Longevidad e Igualdad Reproductiva del Instituto Buck, posible gracias a la Fundación Bia-Echo. Los autores agradecen el apoyo del Instituto de Investigación del Envejecimiento Bakar de la UCSF para la compra de ratones envejecidos, y a los Dres. Leanne Jones y Saul Villeda por la útil discusión.

Federica Franciosi

Dirección actual: Laboratorio de Biología de la Reproducción y el Desarrollo, Departamento de Medicina Veterinaria y Ciencia Animal, Università degli Studi di Milano, 20133, Milán, Italia

Enrico María Daldello

Dirección actual: Universidad de la Sorbona, CNRS, Laboratorio de Biología del Desarrollo—Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, París, Francia

Centro de Ciencias Reproductivas, Universidad de California, San Francisco, CA, 94143, EE. UU.

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang y Marco Conti

EE.UU. Centro Eli y Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Investigación de Células Madre, Universidad de California, San Francisco, CA, 94143, EE.UU.

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang y Marco Conti

Departamento de Obstetricia, Ginecología y Ciencias de la Reproducción, Universidad de California, San Francisco, CA, 94143, EE. UU.

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang y Marco Conti

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

MC diseñó el estudio. NT, FF, EMD, XGL, PA y XW realizaron experimentos. NT y MC analizaron datos. NT y MC escribieron el primer borrador del artículo y todos los autores contribuyeron a su revisión.

Correspondencia a Marco Conti.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Mirko Völkers y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Takahashi, N., Franciosi, F., Daldello, EM et al. Alteración dependiente de CPEB1 del programa de traducción de ARNm en ovocitos durante el envejecimiento materno. Nat Comuna 14, 416 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35994-3

Descargar cita

Recibido: 12 de abril de 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 26 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-35994-3

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.